实验十pUC57T载体的制备
．原理
PCR产物的克隆是一种有效的克隆目的基因的方法，但是在实际应用中，由于方法学上的一些技术问题可能其应用。由于PCR产物3'末端突出一个A,因此克隆PCR产物的载体3'末端必须突出一个T,这样载体与PCR产物之间形成粘性长端。现在许多公司开发出了此类专用于PCR产物克隆的T载体。本实验中将平端内切酶EcoRv酶解的EcoRv，用Taq酶将其3'末端加上T,然后用T4连接酶将能自身环化的质粒连接。用凝胶电泳将自身环化的质粒与3'末端带有T.不能自身环化的线性质粒分开，回收线性质粒片段即为pUC57T载体。
二.方法
1.制备pUC57质粒DNA。(见实验一)
2.用EcoRV酶解pUC57DNA。(见实验九)
3.在酶解的pUC57DNA末端加上T。取一支0.5ml微离心管.加入：EcoRV酶解的pUC57DNA10pg
10XPCR缓冲液15pl
dTTP10mmol/L20pl
TaqDNA聚合酶(5U/pl)1pl
ddHOto150|jl10000r/min离心5s混匀，72°C水浴2h。
4.DNA 片段的纯化
5000r/min离心5min.使液体分层。(1)在上述0.5ml微离心管中加入等体积(15pl)酚/氯仿混匀，放置数分钟，
2倍体积冷无水乙醇，混匀。-20C冰箱放置2h，15000r/min离心15min。 (2)吸收酚/氯仿抽捉提之水相至另一1.5ml离心管中，加入1/10体积的乙酸钠，加
(3)倾去乙醇，加入70％冷乙醇淋洗。
(4)倾去乙醇，滤纸吸干，真空抽吸2?3min。
(5)加人30plddH2O,溶解DNA。
5.载体DNA自身连接2
在DNA片段纯化管中，加入5pl10x连接酶缓冲液和2UT4DNA连接酶，并用重蒸水补至总体积50pl。16C连接16小时。
6.琼脂糖凝胶电泳
将DNA连接液在l%(Wt/V01)琼脂糖凝胶上电泳分离pUC57T载体和原载体7.pUC57T 载体的纯化
用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化线性载体，井用电泳对此载体进行定量。
1.10mmol/LdTTP。
2.TaqDNA 聚合酶，5U/pl
3.酚/氯仿。
4.乙醇.放置-20C冰箱保存备用。
5.乙酸钠，
6.70％冷乙醇
7.ddHO。
2
8．琼脂糖。9．T4DNA连接酶。
10．10X连接酶缓冲液。11．溴酚蓝指示剂
12．EB溶液
13?琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒
四．说明
本实验是一个典型的将具有平齐末端的线性DNA片段变成粘性片段的方法。在基因工程过程中.经常要将平齐末端转变为粘性末端或要将粘性末端转变为平齐末端，除了本实验中的方法外.还有下列方法：
1. 在平齐末端产生新性内切酶位点的方法
(1)试剂
①T4DNA连接酶
②10xT4DNA连接酶反应缓冲液
300mmol／LTris-HCI，pH7.8
100mmol／LMgCl
100mmol／LDTT
10mmol／LATP
注：10X连接酶缓冲液应-20°C保存。不要多次冻存和融化。连接缓冲液中ATP降解连接反应失败的最常见原因。
③磷酸化酶接头
④无核酸酶重蒸水
⑥氯仿：异戊醇(24：1) ⑤性内切酶及其缓冲液
10mmol／LTris—HCIlmmol／LEDTA酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)TE缓冲液
混合等体积的TE缓冲液与重蒸酚，分层后，再将1份下层酚相与1份氯仿：异戊醇(24：1)混合即可。
(2)原理
酶接头是合成的DNA双链，含有性内切酶识别序列，可用于将一个新的性内切酶位点加入到含平端的DNA片段上。商品化的接头有5'末端磷酸化和非磷酸化两种。磷酸化的接头更适于本实验.因为T4DNA连接酶需要一个DNA模板5'末端含磷酸基团。使用磷酸化的接头可以与非磷酸化的载体连接，这样可以降低载体自身重新连接的背景。
(3)方法
① 取一微离心管，分别加入：
10XT4DNA连接酶反应缓冲液1|Jl
DNA(100—500ng)1pl
磷酸化酶接头超过DNA片段的摩尔数100倍?
T4DNA连接酶(Weiss单位)2.5u
加无核酸酶蒸馏水至lO|Jl
*注：1pglkbDNA片段约为1.52pmol.商品酶接头常以A度量对于10碱基的 260
酶接头，0.015A的量相当于大约152pmolDNA。
260
②15°C反应6?18小时。
③70C加热10分钟终止反应。
④立即在冰上冷却反应管，用相应的性内切酶进行酶解，
⑤酶解后，加等体积酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)到反应管中提取DNA，振摇l分钟，12000g离心5分钟。
⑥转移上层水相至另一新离心管中.为增加回收率，有机相用小量TE缓冲液重提一次。
⑦加等体积氯仿；异戊醇(2J1：1),振摇30秒，12OOOg离心2min，移上层水相至另新管中。
⑧用琼脂糖凝胶电泳除掉未连接的酶接头片段，从胶中川收DNA片段。
2. 将5'突出末端转变为平端的方法
(1)试剂'
① 无核酸酶重蒸水
②性内切酶及其缓冲液
③氯仿：异戊醇(2/1：1)
④TE缓冲液
10mmol／LTris-HCl
lmmol/LEDTA
⑤酚：氯仿；异戊醉(24:1)
⑥3mol/L乙酸钠，pH5.2
⑦无水乙醇
⑧70%乙醇
⑩10XDNA聚合酶Klenow片段缓冲液⑨DNA聚合酶大片段(Klenow)
500mmol/LTris—HCl，pH7.2
100mmol/LMgSO
lmmol/LDTF
(11) T4DNA聚合酶
(12) 10xT4DNA聚合酶缓冲液
330mmol/LTris—乙酸pH7.9
660mmol/L乙酸钾
100mmol/L乙酸镁
5mmol/LDDT
(13) 乙酰化牛血清白蛋白，1mg/ml
(14) dNTPs.100mmol/L
(2)原理Klenow(DNA聚合酶大片段)及T4DNA聚合酶都能利用dNTPs补齐5'突出末端(3)Klenow 聚合酶法
①酶解DNA.形成5、突出末端。
②加等体积酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)到反应管中提取DNA,振摇1分钟，12000g离心5分钟。
③转移上层水相至另一新离心管中，为增加回收率，有机相用小量TE缓冲液重提一次。
④加0.1体积3mol/L乙酸钠和2体积无水乙醇，冰上或-20C放置15?30分钟，沉淀
DNA。
⑤4°C12OOOg离心10分钟.如果DNA浓度较低，小于100ng/ml，离心时间为30分钟
这样可增加DNA的回收率。
注：小量DNA的回收也可通过加入核酸如酵母DNA到样品中，使其终浓度达50pg/ml,而改进回收效果。如果tRNA会影响以后DNA的应用，也可使用糖原。
⑥离心弃上清.加200pl70%乙醇。12OOOg4C离心5分钟。
⑦小心移去上清，空气中干燥沉淀。
：40pmol/L每种dNTP及0.1mg/ml乙酰化牛血清白蛋的l倍Klenow酶缓冲液溶⑧用含
解DNA.每微克DNA加入1ulqenowDNA聚合酶。总反应体积在10一100之间均可。
KlcnowDNA聚合酶在许多酶反应缓冲液中(如Promemt的核心缓冲液)有一定活性。这样可直接将酶及40pmol/L每种dNTP加入到酶反应后的反应管中，省略以上的①?⑦步。
将反应管置室温中反应10分钟
75C作用10分钟终止反应。⑨
(2)T4DNA聚合酶法
①采用Klenow聚合酶法的①一⑦步骤纯化DNA。
②用含100pmol/L每种dNTP和0.1mg/ml乙酰化牛血清白蛋白的1倍T4DNA聚合酶反应缓冲液溶解DNA。每微克DNA加5uT4DNA聚合酶
② 75C作用10分钟终止反应。
3?将3'突出末端转变为平端的方法
(1)试剂
①无核酸酶重蒸水
②性内切酶及其缓冲液
④TE缓冲液 ③氯仿：异戊醇(24：1)
⑤酚：氯仿：异戊醇(25:24:1) lmmol/LEDTA lOmmol/LTris—HCI
⑥3mol/L乙酸钠，pH5.2
⑦无水乙醇
⑧70%乙醇
⑨T4DNA聚合酶
⑩10xT4DNA聚合酶缓冲液
330mmol/LTris—乙酸，pH7.9
660mmol/L乙酸钾
100mmol/L乙酸镁
1mmol/LDTT
(11)乙酰化牛血清白蛋白
(12)dNTPs,100mmol/L
(2)原理
在过量dNTP存在下T4DNA聚合酶具有3'一5,核酸外切酶活性，能将3,突出末端转变为平齐末端。
(3)方法
①酶解DNA，形成3'突出末端。
②加等体积酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)到反应管中提取DNA,振摇1分钟，12000g离心5分钟。
③转移上层水相至另一新离心管中，为增加回收率，有机相用小量TE缓冲液重提一次。④加0.1体积3mol/L乙酸钠和2体积无水乙醇，冰上或-20°C放置15?30分钟，沉淀DNA。
⑤4C12000g离心10分钟，如果DNA浓度较低，小于100ng/m1，离心时间为30分钟，这样可增加DNA的回收率。
注：小量DNA的回收也可通过加入核酸如酵母DNA到样品中，使其终浓度达50pg/ml而改进回收效果。如果tRNA会影响以后DNA的应用，也可使用糖原。
⑥离心弃上清，加200》170%乙醇，12000g4C离心5分钟。
⑦小心移去上清，空气中干燥沉淀。
⑧用含100pmol/L,每种dNTP及0.1mg/ml乙酰化牛血清白蛋白的1倍T4DNA聚合酶缓冲液溶解DNA。0.2?5pgDNA的反应体积为20p1,每微克DNA加5uT4DNA聚合酶。
37C反应5分钟。
注：高浓度的dNTPs(100|Jmol/L)将使DNA的降解终止在双链DNA处，。然而，如果dNTPs含量太低，TIDNA聚合酶的外切酶活性则很高.可使双链DNA降解。在本反应中，所有4种dNTP都必须有。
⑨75C作用10分钟，终止反应：
4.部分补齐5，突出末端的方法
对上文介绍的“将5,突出末端转变为平端的方法”进行改进.也可部分补齐5，突出末端。操作步骤与该方法完全相同。只要采用含某一种或某几种碱性dNTP代替含4种dNTP的碱基即可。如XbaI产生的5,突山末端为：“5'-CTAG-3'，如果dNTP变为dCTP，则可将其突出末端转变为“5'-CTA—3'。如果dNTP中仅含dCTP和dTTP，则突出末端可转变为